恒远文献：茶多酚对体外培养鼠晶状体抗氧化损伤作用的研究

茶多酚对体外培养鼠晶状体抗氧化损伤作用的研究

李 佳，刘 丹

摘要目的:观察茶多酚( tea polyphenols，TP) 对氧化损伤鼠晶状体的形态学及抗氧化系统的变化，研究其对晶状体氧化损伤的保护作用。方法:采用体外培养鼠晶状体的氧化损伤模型，设置正常对照组、氧化损伤( H2O2 ) 组和 TP( H2O2 + TP) 组，分别于12，24，48h 后观察各组晶状体的混浊情况，并检测各组晶状体的抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶( SOD) 及谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 活性以及脂质过氧化反应终产物丙二醛( MDA) 的含量。结果:正常对照组晶状体均保持透明，未见白内障形成;H2O2组大鼠离体晶状体随作用时间的延长，晶状体的混浊程度逐渐明显增加; TP 组的晶状体混浊较 H2O2组明显减轻，白内障形成不明显。晶状体混浊相对灰度值组间比较，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。H2O2组大鼠晶状体组织中 MDA 含量较对照组明显增高( P ＜ 0． 05) ，而 GSH-Px和 SOD 明显下降( P ＜ 0． 05) ，TP 组与 H2 O2 组相比，其晶状体中MDA 降低( P ＜ 0． 05) ，但仍高于对照组，而 GSH-Px和 ATP 含量明显升高，差异均有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。结论:TP 可提高氧化损伤晶状体的抗氧化能力，降低脂质过氧化物水平，从而延缓白内障的发生和发展，为临床白内障的诊疗提供了新的理论基础。

关键词:茶多酚; 白内障; 氧化损伤; 过氧化氢DOI

李佳，刘丹． 茶多酚对体外培养鼠晶状体抗氧化损伤作用的研究． 眼科杂志 2012; 12( 2) : 215-2170 引言白内障是世界上主要的致盲病因之一，同时在我国也是位列位的致盲眼病。近些年来国内外学者的研究均指出眼组织内活性氧和氧自由基的增加、抗氧化防御系统力量的削弱是白内障主要成因之一，但对晶状体氧化损伤的途径尚未*清楚，对白内障形成的机制尚有争议［1，2］。因此研究白内障的发病机制，寻找能够延缓白内障发展的药物是防治白内障研究的热点。目前已有很多治疗白内障的药物在使用，但其疗效欠佳［3］。本研究建立体外培养鼠晶状体氧化损伤的模型，应用抗氧化剂茶多酚( tea polyphenols，TP) 对晶状体上皮细胞进行干预，检测晶状体中抗氧化酶系统的活性，从而探讨 TP 对氧化损伤所致白内障的影响作用，为氧化损伤性白内障的防治寻找新的理论依据和途径。

1 材料和方法

1． 1 材料 健康 SD 大鼠 57 只，雌雄各半，体质量 200 ～215Int Eye Sci，Vol． 12，No． 2，Feb． 2012.250g，由辽宁医学院实验动物中心提供。茶 多 酚( 纯 度99． 9% ，上海恒远生物科技有限公司) ，300mL /L 过氧化氢溶液( 南昌市东湖青山试剂助剂厂) 分析纯，复方托吡卡胺滴眼液( 参天制药株式会社) ，超氧化物歧化酶( SOD)测试盒( 南京建成生物工程研究所) ，谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 测试盒( 南京建成生物工程研究所) ，脂质过氧化反应终产物丙二醛( MDA) 测试盒( 南京建成生物工程研究所) ，眼科显微手术器械( 苏州器械六厂) ，超净工作台( 苏州净化设备厂) ，倒置显微镜( IX70 型，日本 Olympus公司) ，CO2细胞培养箱( Forma Scientific，3164) ，裂隙灯显微镜( 苏州仪器六厂) ，扫描电镜( HITACHI，S-570) ，可见分光光度计( 上海菁华科技仪器有限公司，752N) 。

1． 2 方法

1． 2． 1 标本的处理 复方托吡卡胺滴眼液散瞳后于裂隙灯显微镜下检查晶状体的透明性，全部实验大鼠晶状体均透明。将大鼠颈椎脱臼处死后，钳取完整眼球，9g /L 生理盐水冲洗，再用 750mL /L 乙醇冲洗数秒后，用含 320kU/L庆大霉素的 PBS 溶液和含 800kU/L 青霉素、1 000kU/L 链霉素的 PBS 溶液各冲洗 10min。在手术显微镜下从后极部剪开巩膜取出晶状体( 保留部分覆盖在晶状体表面的玻璃体) ，放入含 5kU/L 青霉素、50kU/L 链霉素的 MEM培养基中预培养，以供实验用。

1． 2． 2 实验分组 将筛选出的 114 个晶状体随机分 3 组，其中正常对照组 14 个，氧化损伤( H2O2 ) 组和 TP 组各 50个，每组 12，24，48h 随机选取 4 个晶状体，分组如下: ( 1)正常对照组: MEM 培养液 30mL，内含 100mL /L 小牛血清、5kU/L 青霉素、50kU/L 链霉素; ( 2) H2 O2 组: 除对照组培养液外，另加 300mL /L H2 O2 1． 02μL( H2 O2 终 浓 度 为300μmol /L) ; ( 3) TP 组: 除 H2O2组各成分外，另加 TP 5mL( TP 浓 度 为 0． 2mg /L) 。于 37℃，50mL /L CO2，湿 度 为95% 的培养箱中孵育。除对照组外，其它各组均应在第6，12，18h 分别加入 300mL /L H2O2 0． 8μL，以调节培养液中 H2 O2 浓度达到 300μmol /L。分别在加入培养液后于12，24，48h 停止孵育，取标本进行检测。

1． 2． 3 扫描电镜观察 每组培养 48h 后各取 2 个晶状体，立即置入 25mL /L 戊二醛溶液中固定，0 ～ 4℃ 冰箱内保存，72h 后取出，在赤道部切取 1mm2柱状晶状体结构( 带有囊膜) 作为透射电镜的样本，用 0． 1mol /L 磷酸盐液冲洗，1% 锇酸固定 2h，乙醇梯度脱水，环氧树脂渗透包埋，铀铅重金属染色，扫描电镜观察并照相。

1． 2． 4 晶状体相对灰度值的观察 分别将被检晶状体于12，24，48h 在光学显微镜下观察，在 24 孔板下衬以白底黑色“井”状背景拍照，并观察晶状体混浊程度，将照片扫描入电脑，并用 Micrografx Picture Publisher 软件分析图像中黑色“井”字的每个交叉点的灰度和邻近交叉点的白色背景的灰度，两者之差即为相对灰度值。

1． 2． 5 抗氧化酶活性的测定

1． 2． 5． 1 晶状体谷胱甘肽过氧化物酶的测定 分别于培养 12，24，48h 取出大鼠晶状体，用 0 ～ 4℃ PBS 充分冲洗，再用滤纸吸干后称质量，置入含 5mL 0 ～ 4℃ PBS 的匀浆器内，冰浴下充分研磨 5min 制成匀浆，低温高速离心机10 000r/min 离心 15min，取上清液，羟胺法测定 GSH-Px 含量: 蛋白匀浆液 0． 02mL，10mmol /L pH7． 16 磷酸盐缓冲液1． 43mL，10mmol /L 2，4-二硝基氯苯( CDNB) 0． 05mL，50U/mL谷胱甘肽巯基( GST) 0． 02mL; 标准管加 3． 11mmol /L 还原型谷胱甘肽( GSH) 0． 02mL，于 340nm 处测其光密度。

1． 2． 5． 2 丙二醛的测定 分别于培养 12，24，48h 取出大鼠晶状体，用 0 ～ 4℃ PBS 充分冲洗，再用滤纸吸干后称质量，以 1g 组织加入 9mL 11． 5g /L 氯hua钾液为标准进行匀浆。在不同试管中依次加入不同晶状体匀浆液 0． 2mL，80g /L 十二烷基硫酸钠 0． 2mL，200mL /L 醋酸 1． 5mL 及8g /L 硫代巴 比 妥 酸 1． 5mL，用 双 蒸 馏 水 调 节 终 体 积 至4mL。95℃水浴加热 60min。取出冷却后，加入 3． 5mL 正丁醇与吡啶的混合液( 两液体体积比为 15∶ 1) ，振摇后提取有机层，以四乙氧基丙烷为标准，在荧光分光光度计上测定荧光强度，激发光波长 515nm，发射光波长 553nm，计算 MDA 的量。

1． 2． 5． 3 晶状体超氧化物歧化酶的测定 分别于培养 12，24，48h 取出大鼠晶状体，用0 ～ 4℃ PBS 充分冲洗，再用滤纸吸干后称质量，用旋涡混匀器充分混匀，置 37℃ 恒温水浴 40min，将各管混匀，室温放置 10min，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色测各管 OD 值。统计学分析: 数据用均数 ± 标准差( x珋± s) 表示，采用SPSS 10． 0 统计软件对数据进行分析，采用单因素方差分析和多样本比较的秩和检验，以 P ＜ 0． 05 作为差异有统计学意义。

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