恒远文献：补益中药对运动性肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏

补益中药对运动性肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏炎症因子及 ECM 表达的影响
郑孟君1，曹建民2，郭 娴2，周海涛3
(1． 江南大学 体育学院，江苏 无锡 214000;2． 北京体育大学 运动人体科学学院，北京 100084;
3． 北京联合大学 生物化学工程学院，北京 100023)

摘 要: 观察补益中药对运动性肾缺血再灌注损伤大鼠肾脏炎症因子及 ECM 表达的影响。方法:75 只 7 周龄雄性Wistar 大鼠随机分为 4 组:安静对照组(C 组，12 只)、一般训练组(M 组，12 只)、过度训练组(OM 组，24 只)和补益中药 + 过度训练组(TM 组，24 只)，M、OM、TM 组进行 8 周 56 天的游泳训练。采用专业灌胃器每天灌胃 1 次，TM 组灌胃采用黄芪、红景天、丹参、苦参等组成的复合中药制剂，剂量为 1 g·kg － 1，体积为 5 mL·kg － 1，其他各组灌胃等量生理盐水。末次训练后 24 h，采用 PAS 染色观察肾小球 ECM 沉积情况，免疫组织化学法检测肾组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表达，RT-PCR 法检测肾组织 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA、TGF-β1 mRNA
表达。结果:1)8 周实验后，肾小球 ECM 沉积，C、M 组间无显著差异(P ＞ 0. 05);OM 组较 C、M 组显著增加(P ＜0. 01);TM 组显著低于 OM 组(P ＜ 0. 05)。2)血尿素氮和血清肌酐水平，OM 组和 TM 组显著高于 C 组(P ＜ 0. 01)，TM 组显著低于 OM 组(P ＜ 0. 05);肾组织 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-18 蛋白表达，OM 组和 TM 组显著高于 C 组(P ＜0. 01)，TM 组显著低于 OM 组(P ＜ 0. 05);肾组织 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA 和 IL-18 mRNA 表达，OM、TM 组显著高于 C 组(P ＜ 0. 01)，TM 组显著低于 OM 组(P ＜ 0. 05);肾组织 TGF-β1mRNA 表达，TM 组(P ＜ 0. 05)和OM 组(P ＜ 0. 01)显著高于 C 组，TM 组显著低于 OM 组(P ＜ 0. 05)。结论:8 周过度训练致大鼠发生运动性肾缺血再灌注，同时 ECM 沉积加强。补充补益中药可通过抑制肾脏组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 的表达进而减轻了过度训练诱导肾脏缺血再灌注发生时肾脏组织 TGF-β1 的表达，抑制 ECM 的合成和(或)促进 ECM 的降解及组织病理学变，延缓或避免过度训练导致的运动性缺血再灌注对肾脏的损害。
关键词: 补益中药;运动性肾缺血再灌注损伤;炎症因子;细胞外基质

肾脏对缺血及缺血再灌注损伤异常敏感，运动及其恢复期肾血流量的两个时相的改变导致了运动
性肾缺血再灌注损伤(exercise-related renal ischemiareperfusion injury，ERRIRI) 的整个过程［1］。近年的研究表明:在急性肾缺血再灌注损伤中 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18 这组功能密切相关的炎症细胞因子发挥着重要作用［2］。肾缺血再灌注损伤所导致的炎症因子的表达可以引起肾脏固有细胞的增殖，刺激其表达粘附分子并生成过多的细胞外基质( extracellularmatrix，ECM)，进而影响肾脏细胞外基质代谢平衡，并直接影响到组织细胞结构和功能的变化［3］。中医理论认为，肾藏精，精生髓，髓养骨而通于脑。肾中精气所化生之元气，具有推动人体生长发育，温煦和激发人体各脏腑、经络等组织器官活动的作用，为人体诸气的根本［4］。长期过度训练导致的运动性疲劳，先耗伤脾阳，久则及肾;脾肾同为精血生化之源，阳气之根本，脾肾耗伤，阳气受损，精血生化不足，则导致运动的原动力不足，产生诸多疲劳综合症［5］。具有多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分优势的中药，对过度训练导致的 ERRIRI 的保护作用，已为运动医学界所重视。但目前有关中药对运动训练与炎症细胞因子及肾组织细胞外基质代谢间的相互作用关系的调节功能的研究尚未见报道。故本实验选用黄芪、红景天、丹参、苦参等中药材，结合前期研究适当增减组方制成复合中药制剂，观察其对炎性细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白及基因表达的影响及对肾脏 ECM 代谢、ECM 沉积的调节作用，进而研究补益中药对过度训练导致的运动性肾缺血再灌注损伤的保护作用和机制。
1 材料与方法
1. 1 动物和分组［6］
清洁级 75 只雄性 Wistar 大鼠，49 d 龄，体重(196. 95 ± 11. 36)g，由北京大学医学部实验动物科
学部提供，动物生产合格证编号 SCXK(京)2006 －0008。整个实验中，实验室温度保持在(22 ± 2)℃，
相对湿度 55% ～ 75% ，光照时间随自然变化。大鼠以基础饲料(北京大学医学部实验动物科学部提
供) 和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为63d，正式训练 56d。动物实验于北京体育大学运动
营养实验室完成。大鼠适应性饲养 4 d 后，以 20 min·d － 1的运动量对其进行为期 3d 的筛选，淘汰个别不适应的游泳者，剔除不符合实验要求的大鼠，剩余大鼠以数字随机分组法分为 4 组:对照组(C 组，12 只)、一般训练组(M 组，12 只)、过度训练组(OM 组，24 只)和中药+ 过度训练组(TM 组，24 只)。采用专业灌胃器每天灌胃一次，TM 组剂量为 1 g·kg － 1，灌胃体积为 5mL·kg － 1，其他各组灌胃等量生理盐水。
1. 2 实验用药
复合补益中药制剂主要成分为黄芪、红景天、丹参、苦参等，购自北京同仁堂，批号:120324154，并经
天津中瑞药业有限公司高级工程师高占友鉴定。按比例称取药品 50 g 加水 500 mL，浸泡 30 min 后煎
30 min，过滤所得水煎液，再将过滤后的水煎液加水500 mL 煎 30 min，过滤所得水煎液。将两次过滤的水煎液混合，浓缩至浓度 1 g(生药)·mL － 1，4 ℃ 存放备用［6］。
1. 3 训练及测试方案
C 组常规饲养，不运动，无任何干预。M 组进行正式中等强度游泳训练 8 周(无负重)，每周 6 d，每
天 1 次，第 1 次下水游 20 min，此后逐渐增加，至第 1周末每天游 60 min，第 2 周末加至每天游 90 min，第3 周末加至每天游 120 min，此后 5 周均保持此运动量。TM 组和 OM 组前3 周训练时间安排同 M 组，第4 周起开始安排高强度训练。第 1 ～ 3 周负 0. 5% 体重，第 4 周负 1% 体重，第 5 周负 2% 体重，每天训练1 次。第 6 周负 2% 体重，每天上、下午各训练 1 次，第 7 ～ 8 周，每天上午、下午、夜间各训练 1 次，均负5% 体重［6］。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后 10 s 不露出水面为准。C、M 组大鼠均正常生长，无意外死亡。TM 组和 OM 组大鼠因尾部负重，疲劳、力竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。至第 8 周末时，TM 组 24 只仅剩 14 只，OM 组 24 只仅剩 11 只。
1. 4 指标测定
末次游泳训练 24 h 后，各组大鼠yi醚适度麻醉，颈总动脉取血，加入柠檬酸钠溶液抗凝，37 ℃ 水浴 30 min 后，4 ℃、3 000 r /min 离心 10 min，分离制备血清，置 － 20 ℃ 冰箱中保存待查。迅速取肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，观察肾脏大小、色泽、质地，切取肾组织，分别用消毒铝箔包好，迅速投入液氮暂存，随后保存于 － 70 ℃ 冰箱冻存待测［6］。取部分肾组织，10% 甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm 厚切片，PAS 染色并进行组织病理学分析。采用 Jaffe ku味酸法测定血清肌酐，采用二乙酰 － 肟法测定血清尿素氮，采用免疫组织化学法测定检测肾组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表达，采用 RTPCR 法测定肾组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、TGF-β1 基因表达。以上试剂盒均由上海恒远生物科技有限公司提供。
1. 5 PAS 染色切片图像分析
PAS 染色切片，在 400 × 物镜下采用北航图像采集模块软件采集视野中同时切到尿极和血管极的肾小球(每张切片约有 8 ～ 10 个)，随后运用北航医学病理图像分析软件描绘肾小球毛细血管拌轮廓，区分基质和细胞成分，并测量单个肾小球平均面积及其基质面积［18］。
1. 6 统计学分析
采用 SPSS 12. 0 软件对所有数据进行分析、处理，数据用平均数 ± 标准差(X珔± S)表示，组间差异
采用方差分析，等级计数资料采用秩和检验分析，相关关系采用 Pearson 相关分析。显著性水平为 P ＜0. 05，非常显著性水平为 P ＜ 0. 01。

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