恒远文献：肝郁脾虚泄泻大鼠模型的建立及评价

肝郁脾虚泄泻大鼠模型的建立及评价
张庆业1，廖小红1，范丽霞1，涂星1，2，房财富3，唐洪梅1
( 1． 广州中医药大学第一附属医院，广州 510405; 2． 广州中医药大学，广州 510006;
3． 中山大学附属肿瘤医院药学部，广州 510407)

【摘要】 目的 采用多因素刺激方法建立吻合人类“肝郁脾虚泄泻”疾病特征的大鼠模型，并选取操作简单、结论实时、科学经济的评价指标。方法 将幼年 SD 大鼠随机分为空白组和模型组，模型组采用母婴分离、束缚刺激、直肠醋酸刺激三种因素复合造模，选择不同时间测定大鼠体重变化、直肠敏感性、大鼠粪便分型积分及粪便含水量等指标，客观验证肝郁脾虚泄泻模型是否成功。结果 模型大鼠出现食欲减退，饮水量增大，尿液减少的病理现象，部分大鼠出现活动增加、甚至躁狂。粪便积分在 5 ～ 7 分，粪便含水量远远高于正常组大鼠，而肠道敏感性显著增加。结论 该模型较好的模拟了肝郁脾虚泄泻的临床表现，能满足该类疾病的相关研究。
【关键词】 肝郁脾虚泄泻; 动物模型; 母婴分离; 直肠敏感性

中医学认为，肝属木，主疏泄，喜条达而恶抑郁;脾( 胃) 属土，主运化，脾气宜清宜升，胃主受纳腐熟，胃气宜降宜和，共同完成机体对饮食物的消化吸收和输布功能。若肝失疏泄，脾失运化，发为“肝郁
脾虚”，容易引起慢性泄泻，与西医病症肠易激综合征( IBS) 症状相似［1 － 3］。肝郁脾虚泄泻可见于许多疾病，如肠易激综合征、慢性胃炎、消化性溃疡等，在临床上的十分常见，如肠易激综合征在青少年人群中患病率就高达 10% ～ 20%［4］。国内外众多学者从肝郁脾虚泄泻临床症状特点出发建立了多种模型，取得了一定的成果，但研究中还存在模型的建立与中医发病机理不*符合、评价指标未能量化表示等问题［5，6］。本研究依据肝郁脾虚证的发病学说，运用精神 － 神经 － 外周刺激三种因素复合造模法构建肝郁脾虚证大鼠模型，模拟出符合肝郁脾虚证候及泄泻特点的模型，并且通过可量化测定、操作性强的多项指标评价模型，使模型可以重复操作。
1 实验材料
1. 1 动物及饲养初生 SPF 级 SD 大鼠 4 窝( 30 只) ，购自广州中医药大学实验动物中心【SCXK( 粤) 2013 － 0020】，雄雌不限，与母鼠同笼，第 14 天后断奶并与母鼠分笼，在广州中医药大学第一附属医院实验中心 SPF级实验环境下操作【SYXK( 粤) 2013 － 0092】，常规摄食饮水，光照为保持昼夜节律各 12h。温度控制在 18 ～ 24℃，相对湿度控制在 50% ～ 70% ，实验时室温维持在 24 ～ 26℃。
1. 2 试剂和仪器
醋酸; yi醚; 4% 甲醛; 静脉留置管; 石蜡油; HE染色 液; 龙 胆 紫 液; 0. 01 mol /L PBS 缓 冲 液 ( pH7. 4) ; 75% 酒 精; 二 甲 苯; 中 性 树 胶; 生 理 盐 水;1 mL、5 mL、10 mL 注射器; 手术胶手套; 电子秤; 血压计; 大鼠血管活性肠肽 ELISA 检测试剂盒( 含量≥99% ，规格: 96T，上海恒远生物科技有限公司) 。2 模型制作与评价方法
2. 1 动物分组和造模［5］实验用幼年 SD 大鼠从出生第 2 天起开始造模，随机分为正常对照组( n =10) 、模型组( n = 20) 。肝郁脾虚泄泻模型组: SD 乳鼠从第 1 ～ 7 天适应性饲养，从第 8 ～ 21 天，将乳鼠每天取出单独小笼饲养2 h，再将乳鼠用yi醚麻醉后，用自制的直肠刺激注射装置经石蜡油润滑后轻柔地插入肛men，在 8 ～ 14 d时插入约 3 cm，在 15 ～ 21d 时插入约 5 cm，每次插入稳定后，注入 0. 5% 的醋酸每次 0. 4 mL /d，注入醋酸后，注射管在肠内停留 1 ～ 2 min，以免醋酸流出。在 22 ～ 35d 时大鼠用纸带束缚前肩、前上肢及胸bu，束缚时间为 2 h /d，期间单独分离饲养，不限活动。正常对照组按相同处理方法直肠注射生理盐水，不做束缚处理。造模时，幼鼠放置到单独的小笼造模，造模完毕后放回与母鼠同笼饲养，第 42 天造模结束。
2. 2 模型的评价及机理分析
2. 2. 1 大鼠体重及行为学评价记录大鼠在实验过程中饮水、食欲、活动情况等变化，在造模开始的第7、35、42、49、56 天进行称量大鼠体重，取三次测试的平均值，比较模型组与对照组大鼠体重情况。
2. 2. 2 大鼠粪便 Bristol 分型积分及含水量测定在造模开始的第 35 天、第 49 天、第 63 天进行测试大鼠粪便分型评分，取三轮测试的平均值，并测定粪便含水量，判断其是否属于便秘还是腹泻。粪便测试方法如下: 每天将模型大鼠单独置于代谢笼内 4h，测试期间禁水禁食，单独静置，收集 4h 内大鼠的粪便，比较同日龄模型组与空白组幼鼠粪便差异，包括粪便溏稀程度、粪便形状、粪便颜色改变、有无异物等。并根据 Bristol 大便性状图谱记录大便性状［7］( Bristol 大便性状分型: 1 型为分离的硬团，2型为团块状，3 型为干裂的香肠状，4 型为柔软的香肠状，5 型为软的团块，6 型为泥浆状，7 型为水样
便。其中 1、2 型为便秘( constipation) ; 3、4 型为正常( ideal stools) ; 5、6、7 为腹泻( diarrhea or urgency) 。按照中国药典附录烘干法测定粪便含水量。
2. 2. 3 直肠敏感性测试在造模后的第 35 天、第 49 天、第 63 天对各组幼鼠进行大鼠的腹部回缩反射( AWＲ) 测试，将血压计、针管与自制指套气囊用三通管连接，用针管向气囊内打气时可以在血压计上读出气囊内压力。大鼠在自制的密封麻醉瓶进行yi醚麻醉后，把用石蜡油润滑后的气囊经肛men轻柔地插入约 3 ～ 5 cm，气囊末端距肛men 1 cm，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，固定气囊。大鼠苏醒后，将其放在特制的不能转身的透明塑料瓶内。15 min 后待大鼠适应环境，在大鼠意识*清醒的情况下逐渐打气扩张肠道，分别观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的压力阈值，相应的 AWＲ 腹部有回撤反应的标准参照Al-Chaer［8］的方法进行评分。记录第 2 分或第 3 分的压力值，当大鼠出现 1 分或 4 分时，待大鼠充分休息后重新测试。为得到准确的评估结果，对每一阈值都重复进行 3 次扩张，数据取均值。
2. 2. 4 结肠 HE 染色分析正常组和模型组大鼠在第 42 日龄时，将实验大鼠禁食 1d 后，腹腔注射 10% 水合氯醛( 0. 3 mL /100g) 麻醉处死大鼠，分离直肠和结肠，剪取乙状结肠肠段 2cm 及近降结肠处直肠肠段 1 cm，水洗净，浸入 5% 福尔马林液中备用。使用脱水机和包埋机对大鼠标本进行石蜡包埋，标本用石蜡包埋后，放进全自动石蜡切片机中切片: 4℃ 冰箱预冷 40 min，以锋利刀片切出 1 μm 的切片，贴附于载玻片上备用。大鼠的结肠标本完成包埋后，放进常规染色的说明书操作步骤进行操作。
2. 3 统计方法

应用 SPSS 13. 0 统计软件包进行统计学处理，各组实验数据均用均数 ± 标准差( x珋± s) 表示，组间变量比较用 t 检验，以 P ＜ 0. 05 有统计学意义。

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